瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析
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瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析
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問題 |
可能原因 |
解決方法 |
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DNA Marker降解 |
核酸酶污染 |
每次吸取時更換滅菌槍頭，勿將電泳緩沖液帶入管中；用后密閉4°C保存 |
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保存不當(dāng) |
4°C 或-20°C保存，避免多次反復(fù)凍融；不可加熱 |
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DNA Marker無法正確分離 |
瓊脂糖質(zhì)量差 |
使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠 |
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電泳緩沖液多次使用后失效 |
更換緩沖液 |
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條帶黯淡 |
核酸濃度過低 |
增加上樣量 |
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核酸降解 |
使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品 |
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DNA條帶被示蹤染料掩蓋 |
提高上樣量；避免使用與目的片段遷移率相同的示蹤染料 |
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條帶模糊或彌散 |
電泳緩沖液多次使用后失效 |
更換緩沖液 |
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核酸部分降解 |
使用不含核酸酶的試劑和耗材制備樣品 |
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核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì) |
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電壓過低，電泳時間過長 |
根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當(dāng)?shù)碾妷哼M行電泳 |
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染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散 |
電泳結(jié)束后及時觀察、拍照 |
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條帶缺失 |
DNA條帶分子量過大 |
使用脈沖凝膠電泳 |
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分子量接近的DNA條帶沒有分開 |
選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進行電泳 |
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電泳緩沖液使用不當(dāng) |
SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段 |
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電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠 |
縮短電泳時間，調(diào)整電壓 |
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電插反，DNA走出凝膠 |
正確連接電方向 |
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條帶大小不正確 |
核酸降解或形成聚合物 |
加熱處理或重新制備樣品 |
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λ DNA酶切Marker的cos位點復(fù)性 |
電泳前65°C加熱5分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣 |
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相同分子量的DNA片段由于結(jié)構(gòu)或序列的差異而有不同的遷移率 |
判斷DNA分子是否有特殊結(jié)構(gòu)，如缺口、超螺旋、二聚體等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分子量富含GC堿基的DNA片段慢 |
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梳子變形，點樣孔不在同一水平線上 |
使用完好的梳子制膠 |
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帶型異常 |
不同樣本的上樣條件不同 |
選用相同的上樣緩沖液，上樣量盡可能接近 |
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上樣量過大或過小 |
選擇合適大小的上樣孔，樣品應(yīng)完全覆蓋點樣孔底部 |
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核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽份 |
酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì) |
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電泳緩沖液未完全浸沒凝膠 |
上樣和電泳時，確保緩沖液始終能完全覆蓋凝膠 |
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電壓過高或電泳時間過長致使凝膠過熱和DNA變性 |
根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型，使用適當(dāng)?shù)碾妷哼M行電泳 |
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凝膠中加入EB造成染色不均 |
加入EB時充分混勻或電泳結(jié)束后再染色 |
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凝膠中有氣泡或污染物 |
使用純水和潔凈容器制膠；緩慢灌膠，并趕除氣泡 |
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點樣孔質(zhì)量差 |
待凝膠完全凝聚后再取出梳子 |
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小片段擴散,條帶模糊,粗 |
錯誤選擇了低濃度凝膠,觀察大片段用低濃度凝膠,觀察小片段要用高濃度 |
比如觀察100bp的小片段用2%凝膠跑電泳 |
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瓊脂糖質(zhì)量不好,質(zhì)量不好的瓊脂糖分離小片段容易擴散,即使是使用高濃度凝膠 |
換用質(zhì)量好的瓊脂糖 |
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選擇了不合適的電泳緩沖液 |
SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分離；TAE緩沖液不適于分離很小的DNA片段 |
DNA凝膠電泳簡介
一、實驗原理
DNA電泳是基因工程中zui基本的技術(shù)，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據(jù)分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩類：
1、聚丙烯酰胺凝膠電泳 適合分離1kb以下的片段，zui高分辨率可達1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。
2、瓊脂糖凝膠電泳 可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.5～0.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。電泳結(jié)果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。
二、瓊脂糖凝膠
瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。表1給出了不同濃度凝膠對DNA片段的線性分離范圍。
表1不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍
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瓊脂糖/％ |
標(biāo)準(zhǔn) |
高強度 |
低熔點 |
低粘度低熔點 |
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0.3 |
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0.5 |
700bp～25kb |
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0.8 |
500bp～15kb |
800bp～10kb |
800bp～10kb |
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1.0 |
250bp～12kb |
400bp～8kb |
400bp～8kb |
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1.2 |
150bp～6kb |
300bp～7kb |
300bp~7kb |
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1.5 |
80bp~4kb |
200bp~4kb |
200bp~4kb |
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2.0 |
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100bp~3kb |
100bp~3kb |
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3.0 |
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500bp~1kb |
500bp~1kb |
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4.0 |
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100bp~500bp |
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6.0 |
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10bp～100bp |
由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，象NaClO4能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。
隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，也針對不同用途開發(fā)了各種類型的瓊脂糖凝膠：（1）低熔點瓊脂糖凝膠，用于DNA片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接等；（2）高熔點凝膠，可分離小于1kb的DNA片段，專用于PCR產(chǎn)物的分析；（3）快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節(jié)省實驗時間；（4）適用于DNA大片段的分離。（5）其它類型。各生產(chǎn)商還開發(fā)很多類型的凝膠，可根據(jù)實驗要求選擇不同類型的，選擇原則是考慮合適的機械強度和熔點。
三、DNA電泳影響因素
DNA為堿性物質(zhì)，在電泳（緩沖液pH=8）時帶負電荷，在一定的電場力作用下向正泳動。而DNA鏈上的負電荷伴隨著DNA分子量的增加而增加，荷質(zhì)比是一常數(shù)，故電泳中DNA的分離類似分子篩效應(yīng)。電泳中影響DNA分子泳動的因素很多，主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。
1、DNA分子大?。篋NA分子越大在膠中的摩擦阻力就越大，泳動也越慢，遷移速率與線狀DNA分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比。
2、DNA分子構(gòu)型：對于質(zhì)粒DNA分子即使具有相同分子質(zhì)量，因構(gòu)型不同也會造成電泳時受到的阻力不同，zui終造成泳動速率的不同。常規(guī)電泳中質(zhì)粒DNA分子的3種構(gòu)型泳動速率：超螺旋zui快、線狀分子次之，開環(huán)分子zui慢。
3、不同的膠濃度：對于同種DNA分子膠濃度越高，電泳速率越慢。不同膠濃度對于DNA片段呈線性關(guān)系有所區(qū)別，濃度較稀的膠線性范圍較寬，而濃的膠對小分子DNA片段呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。所以常規(guī)實驗中對于小片段DNA分子的分離采用高濃度的膠分離（有時甚至用2％的凝膠），而對于分離大片段則用低濃度的凝膠。
4、電場強度：電泳時為了盡快得到實驗結(jié)果，所用的電場強度約為5V/cm，這樣的場強下雖能得到結(jié)果，但分辨率不高。在精que測定DNA分子大小時，應(yīng)降低電壓至1V/cm。電場強度偏高時電泳分離的線性范圍會變窄，電壓過高時也會由于電泳中產(chǎn)生的大量熱量導(dǎo)致DNA片段的降解。實驗中要根據(jù)需要選擇合適電壓，如對于DNA大片段的分離可適當(dāng)選擇較低電壓進行（在Southern雜交中的DNA電泳），避免托尾現(xiàn)象的產(chǎn)生；而對于小分子DNA，由于其在凝膠中的快速擴散會導(dǎo)致條帶模糊，可選用相對較高的電泳以縮短電泳時間。
5、溴化乙錠：簡稱EB，電泳中的染色劑，具有扁平結(jié)構(gòu)，能嵌入到DNA堿基對間，對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。當(dāng)DNA分子中嵌入的EB分子逐漸增多時，原來為負超螺旋狀態(tài)的分子開始向共價閉合環(huán)狀轉(zhuǎn)變，電泳遷移速度由快變慢；當(dāng)嵌入的EB分子進一步增加時，DNA分子由共價閉合環(huán)狀向正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這時電泳遷移速率又由慢變快。這個臨界點的游離EB質(zhì)量濃度為0.1g/ml~0.5g/ml，即電泳時所加的濃度。因此一般電泳可以忽略此因素，而對于特殊電泳，消除此因素影響可采用電泳后染色。
6、電泳緩沖液：目前有3種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳：TAE、TBE和TPE，其組成及特點見表2。一般常用的DNA電泳選用TAE較多，其電泳時間較快，而且成本比較低，但是其緩沖容量較低，需經(jīng)常更換電泳液。
表2 常用DNA電泳緩沖液
四、DNA上樣緩沖液
電泳中DNA點樣前必須加入一定量的上樣緩沖液，主要作用如下：
1、螯合Mg2+，防止電泳過程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mmol/L的EDTA。
2、增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。而在大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。
3、指示劑監(jiān)測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。
目前廠商提供的限制性內(nèi)切酶中都有贈送的上樣緩沖液，一般為10×上樣緩沖液，DNA樣品中僅需加入1/10的量即可，加入過多的上樣緩沖液會造成電泳輕微的托尾現(xiàn)象。
五、DNA上樣量的控制
在分析性電泳中，一般樣品投入量達50～100ng/帶即可觀察到清晰結(jié)果，而對于珍貴DNA樣品則上樣量達電泳的zui低分辨率5～10ng/帶也可。而對于一定量的DNA，當(dāng)電泳時采用較薄的梳子制膠，則電泳時DNA條帶相對較窄，觀察較清晰；而隨著電泳時間的延長，由于DNA分子本身有一定的擴散，電泳條帶也會變淺。
對于染色體DNA的酶切片段包含各種大小的條帶，上樣量即使超過10mg條帶也不會托尾，而單一條帶（>10 kb）當(dāng)上樣量超過200ng就有可能產(chǎn)生托尾現(xiàn)象。
