WE0197 血液RNA提取試劑盒

血液RNA提取試劑盒是高品質(zhì)的RNA提取純化產(chǎn)品，由北京百奧萊博供應(yīng)，本產(chǎn)品用于科研目的，我公司的血液RNA提取試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括血液RNA提取試劑盒(含DNase I)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：血液RNA提取試劑盒(含DNase I)
英文名稱：RNAtiqu Blood RNA Extraction Kit(DNase I)
產(chǎn)品貨號：WE0197
產(chǎn)品規(guī)格：50次

  本試劑盒適用于從新鮮全血(用檸檬酸鹽、EDTA或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品)中提取總RNA，可處理多至1.5ml的全血，洗脫得到分子量大于200 bp的高純度RNA，多個樣品可以在1小時內(nèi)同時完成。本產(chǎn)品無需CsCl純化的超離心步驟和LiCl或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯fǎng等有毒溶劑，經(jīng)過純化的RNA有效去除血紅素、肝素等酶抑制劑和污染物，可直接用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成：

組份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
Buffer RBL(10×)	60ml
Buffer RL	35ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(濃縮液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
過濾柱FL及收集管	50套
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free離心管(1.5ml)	50個

保存條件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：
1、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1)使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2)配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。
3)操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。
2、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則影響提取RNA提取得率和質(zhì)量。樣品在Buffer RL中，可于-70℃保存一個月。
3、Buffer RL在使用前請加入β-巰基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個月。
4、次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。
5、使用前請檢查Buffer RL是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可置于于56℃水浴重新溶解。
6、本試劑盒不能用于加入抗凝劑的冷凍血液樣本RNA的提取。
7、10×Buffer RBL需在使用前將溶液用無RNase的水進(jìn)行10倍稀釋，稀釋后置于2～8℃保存。

操作步驟：
1、向新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍血液樣本體積的1×Buffer RBL(請于使用前用無RNase水將10×Buffer RBL稀釋10倍)，輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鐘，孵育過程中混勻兩次。
注意：孵育過程中渾濁的懸液會變成透明，證明紅細(xì)胞被裂解，必要時可以把孵育時間延長至20分鐘。
2、4℃ 2,100 rpm(~400×g)離心10分鐘，小心吸棄上清。
3、向以上沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Buffer RBL(請于使用前用無RNase水將10×Buffer RBL稀釋10倍)，輕輕渦旋，充分重懸沉淀。
4、4℃ 2,100 rpm離心10分鐘，小心并徹底吸棄上清。
注意：此步一定要完全去除上清否則影響裂解導(dǎo)致RNA產(chǎn)量下降。
5、向沉淀中加入Buffer RL(使用前檢查是否已經(jīng)加入β-巰基乙醇)，具體加量按照下表進(jìn)行，渦旋混勻。
注意：如果血液不是健康人的全血，需要根據(jù)血液中白細(xì)胞的數(shù)量來確定所需Buffer RL的加入量。完全混勻后細(xì)胞應(yīng)完全裂解，塊狀沉淀消失。

Buffer RL(μl)	健康人類全血(ml)	白細(xì)胞數(shù)量
350	小于0.5	多至2×106
600	0.5-1.5	2×106 至1×107

6、將以上所得液體轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的過濾柱中，12000rpm(~～13400×g)離心2分鐘，收集濾液，棄掉過濾柱。
7、向?yàn)V液中加入1倍體積(600μl或350μl)的70%乙醇(無RNase水配制)，混勻。
注意：加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
8、將上步所得溶液全部加入到吸附柱中(已裝入收集管)，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混勻， 配制成終體積為80μl的反應(yīng)液。
11、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
12、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
13、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
14、重復(fù)步驟13。
15、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR 等)。
16、將吸附柱置于一個新的RNase-Free的1.5ml離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位加入30-50μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1)RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30μl，體積過小影響回收率。
2)如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50μl新的RNase-Free Water再次洗脫，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘。
3)如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘。

儲存條件：室溫(15～30℃)。

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名稱：動物RNA提取試劑(TRIzol)
貨號：BTN3070
規(guī)格：100mL
本試劑盒是類似于TRIzol、基于異硫氰酸胍/酚/氯fǎng提取原理的快速總RNA提取試劑，可用于從各種動物組織(包括白細(xì)胞)和部分植物材料中快速提取總RNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 操作簡單快速，只要10分鐘左右，可以全在室溫下進(jìn)行。
2. RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280一般在1.9左右。一般不含用RT-PCR可以檢測到的基因組DNA污染。
3.適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料，如培養(yǎng)細(xì)胞、各種動物材料和少數(shù)植物材料。植物RNA的提取zuì好使用植物RNA提取試劑盒。
4. 高于進(jìn)口TRIzol和TRI Reagent等同類產(chǎn)品。

儲存條件：常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
注意：下面的操作步驟是用1mL 本產(chǎn)品進(jìn)行的微量提取的，細(xì)胞使用量一定要準(zhǔn)確，不能超過下述用量，否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力，RNA產(chǎn)量將急劇降低。如果樣品量大，請按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境zuì好用的固相RNase清除劑(BTN3080)徹底處理。
1. 對貼壁細(xì)胞(10 平方厘米)：吸盡培養(yǎng)液，加入1mL的本產(chǎn)品用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。
2. 對懸浮細(xì)胞(五百萬至一千萬個)：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，加入1mL本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。
3. 對新鮮組織(50-100mg)：將新鮮組織剪切成小塊，放入10mL或15mL塑料離心管中，加入1mL的本產(chǎn)品，用Polytron 剪切式勻漿器冰上勻漿30秒左右，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL塑料離心管中，進(jìn)入第6步。注意：對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織(細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的DNA)，使用量不要超過30-50mg，否則十分容易產(chǎn)生DNA污染。對10mg以下的組織，zuì好加入本公司的微量RNA 助沉劑。
4. 對RNAhold 保存的組織(50-100mg)：先用紙吸去RNAhold液體后再剪切成小塊，其余操作同第3 步。RNAhold處理后的組織韌性很強(qiáng)，勻漿時間需要適當(dāng)延長。
5. 對液氮中保存的組織(50-100mg)：在研缽中研磨成粉，加入1mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL塑料離心管中，進(jìn)入第6 步。
6.在裝有裂解物/勻漿物的1.5mL塑料離心管中加入0.2mL自備氯fǎng，振蕩器上充分振蕩混均30秒。注意：一定要把官底的溶液震蕩起來，否則只是液面的振動。
7. 13000-15000g室溫離心3分鐘。
8. 將上清液(約0.6mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5mL塑料離心管中。下層有機(jī)相(藍(lán)色)和中間層含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA污染。為保險起見，可以留下50-100μl上清液不取。
9. 對脂類豐富的組織(如脂肪組織和腦組織)，需再重復(fù)氯fǎng抽提一到兩次以讓氯fǎng充分去除脂類分子。
10.在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩30秒混勻。
11. 13000-15000g室溫離心5分鐘，離心底的側(cè)面將形成RNA沉淀。如果組織使用量低于10mg或需要提高RNA 回收率，可以將離心時間延長到20或30分鐘。
12.小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。
13.在含RNA沉淀的離心管中加入1mL 75%乙醇，振蕩混勻30秒。
14. 13000-15000g室溫離心1分鐘。
15.小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA沉淀。
16. 重復(fù)第13-15的洗滌步驟一次(也可以省略)。
17. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約50μL)。注意不要吸棄RNA
沉淀。此步十分重要，否則殘留的乙醇會影響RNA的后續(xù)使用。
18.室溫放1-2分鐘后立即加入50-100μl RNase-free 水使RNA沉淀溶解。
千萬不要用真空離心法使RNA沉淀過于干燥，否則RNA 將變得十分難溶。RNA樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。
注意：由于RNase-free 水沒有主動滅活殘留RNase的功能，而任何方法提取的RNA 都可能有殘留的RNase，所以強(qiáng)烈建議客戶使用本公司推出的具有主動滅活殘留RNase 功能的、同時跟后續(xù)RT-PCR等反應(yīng)兼容的液相RNase 清除劑(BTN3091)。

附一：RNA 完整性的電泳檢測(僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑)
如果需要做Northern雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。如果是簡單檢測，可以使用TAE緩沖液或超快核酸電泳液進(jìn)行常規(guī)電泳，但文獻(xiàn)報道必須使用RNAload這樣的變性上樣液(BioTechniques，9：558，1990)。普通DNA上樣液不含變性劑，也沒經(jīng)過去RNase處理，所以zuì好不要使用，否則RNA容易降解。
動物RNA電泳后應(yīng)該在UV下呈現(xiàn)三條清晰的rRNA 帶，28S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比18S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng)1.5-2.3倍。如果這兩條rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示RNA 有降解(因?yàn)榇蟮腞NA 被酶降解的可能更大)。
跟動物一樣，植物果實(shí)和種子的RNA一般有三條電泳帶，但植物葉片的RNA 有四條或更多rRNA帶，多余的RNA 來源于葉綠體。
如果電泳發(fā)現(xiàn)RNA樣品中有DNA污染(一般是使用過多樣品造成)，可分別用非酶DNA 清除劑或RNase-free DNase 清除。

附二：RNA產(chǎn)量和純度測定(僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑)
用pH在7.5-8.2的TE緩沖液將5-10μL RNA稀釋10-20倍后在OD260和OD260測光吸收，通過光吸收可以得出RNA濃度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，進(jìn)而計算出RNA的產(chǎn)量(濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。RNA的產(chǎn)率還隨組織的營養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不同，一般來說，代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA的產(chǎn)率高，代謝不旺盛的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA的產(chǎn)率低，下面是常見動物組織的RNA產(chǎn)率:
肌肉，胎盤和腦組織: 1-2μg RNA/mg 組織
肝，胰和腎組織: 5-10μg RNA/mg 組織
培養(yǎng)細(xì)胞: 5-15μg/10E6細(xì)胞
RNA的純度通過OD260/OD280 來確定，一般在1.8-2.1之間即算合格。但即使低于此范圍，一般也不會影響RT-PCR等反應(yīng)。
蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯fǎng抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可以用多糖清除劑去除。

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