如何選擇優(yōu)化的包被條件?

1.包被抗原的選擇

包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類。 天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過特 異性反應(yīng)使抗原固相化)。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板 上，一般都先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。

2.包被液的選擇一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

3.包被溫度的選擇通常是4-8度條件下過夜或者37度保溫2小時，我們強烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。

4. 包被濃度的選擇包被的適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對特定包被抗原的適包被濃度需要通過實驗來確定。包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物 是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。而在間接法測定中，封閉一般是必不可少的。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、 10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價廉而且封閉能力強，不過5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜長期保 存，所以ELISA試劑盒中較少使用。