一、蛋白marker是什么？

在WB實(shí)驗(yàn)中，蛋白marker的作用主要是用來指示蛋白條帶所對應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量無誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說服力，除此之外，蛋白標(biāo)準(zhǔn)還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一。

二、蛋白marker的分類

總體來說，蛋白Marker可以分成未預(yù)染蛋白marker、預(yù)染marker二個(gè)級別。

1. 未染色（pre mixed）蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

未預(yù)染蛋白marker即寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)以及低分子量蛋白marker。

未染色的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)是簡單，也是準(zhǔn)確的一種。由于沒有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是判斷蛋白大小必須的?，F(xiàn)在的Marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因?yàn)榛旌系臈l帶越多，越不好記，所以當(dāng)看到特別濃的那幾條可以作為標(biāo)志帶。不過小帶通常都不那么容易看清楚。在選擇上來說，當(dāng)然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的好，越近越好。預(yù)混的Marker使用上不如預(yù)染Marker（pre-stained）好用，因?yàn)殡娪具^程中完全看不到，要和目標(biāo)蛋白一起等到后染色才可以看到，無法對實(shí)驗(yàn)起預(yù)示參照作用。完全屬于“后知后覺”型的。

① 寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)

如果從實(shí)驗(yàn)室總體考慮的，就選范圍盡量寬，條帶分布比較均勻的，這樣你的蛋白無論在哪個(gè)區(qū)間都容易判斷，避免正好落在一段空白區(qū)。不過條帶越多，相應(yīng)的上樣量也會增加。拿到Marker后，如果買的是大包裝，就應(yīng)該考慮分裝，避免多次反復(fù)凍融。另外寬譜的Marker不一定每條都能看到的，特別是Mini Cell。如果側(cè)重大蛋白，那小的可能就已經(jīng)跑掉了。

② 高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)

通常在檢測大分子量蛋白經(jīng)常使用到高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)

③ 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)

在一般的蛋白電泳當(dāng)中，常用的是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，除了有指示蛋白大小的作用以外，有時(shí)還可以用作粗略的定量。實(shí)驗(yàn)室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)中。

在低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)這里還包括可特別小的蛋白標(biāo)準(zhǔn)，比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標(biāo)準(zhǔn)挺不錯(cuò)，另外特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好，上樣一定要上足夠的量。

2.預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

預(yù)染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物，通過與染料共價(jià)耦聯(lián)，在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時(shí)可以直接觀察到。預(yù)染蛋白分子量的出現(xiàn)方便了我們的實(shí)驗(yàn)，這種蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以幫助我們在電泳時(shí)、電泳后，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測電泳情況和估計(jì)遷移率——比如，已知垂直電泳佳分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測目標(biāo)蛋白進(jìn)入佳分辨區(qū)時(shí)停止電泳以得到佳分辨效果；如果觀察到Marker電泳異常也可以及時(shí)終止電泳；另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全，還可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量，所以吸引了許多實(shí)驗(yàn)室人員購買預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)。值得注意的是預(yù)染蛋白Marker與染料共價(jià)耦聯(lián)，所以在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會發(fā)生某些變化，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合定位蛋白——不過多數(shù)情況下Marker的條帶未必能和我們的目標(biāo)蛋白完全一樣，我們得到的也不過是一種相對Marker指示的參考大小，后都需要Western來定性，所以如果不是要區(qū)分大小相近的條帶，預(yù)染Marker還是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。

預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以分為兩種：單色預(yù)染和多色預(yù)染，其實(shí)區(qū)別就在于幫助在實(shí)驗(yàn)過程中辨認(rèn)某個(gè)條帶的大小——Marker條帶越多參考價(jià)值越大，可就越難辨認(rèn)區(qū)分，如果用不同的顏色來區(qū)別就比較好辨認(rèn)；單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小的。還有一點(diǎn)特別要注意，由于轉(zhuǎn)膜是一個(gè)將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上，所以需要的上樣量相對少一些，如果想要在電泳過程中看到美麗的“彩虹”，或者單色的Marker往往需要比說明書里多加一些Marker的。

三．Western專用的標(biāo)記蛋白marker

①生物素標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)

未染色的Marker在做Western時(shí)，需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不干擾Western Blot的染色方法顯色，在膠上做標(biāo)記后才能“拼”在后的結(jié)果中，如果是預(yù)染的Marker就要在轉(zhuǎn)膜后標(biāo)記膜，或者剪膜，后在“拼上”。要是想直接將Marker結(jié)果顯示在后結(jié)果上，不用手工作圖或者拼接，那就要Western專用的Marker了。比如生物素標(biāo)記的蛋白標(biāo)準(zhǔn)。這種方法主要是配合化學(xué)發(fā)光法：在蛋白分子量上標(biāo)記生物素，通過帶有抗生物素的抗體或者偶聯(lián)鏈親霉素的抗體，在化學(xué)發(fā)光檢測到目的蛋白帶時(shí)就可以同時(shí)看到相應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)一起發(fā)光顯影了。不同于普通蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的便宜、預(yù)染蛋白分子量的方便，這一方法的優(yōu)點(diǎn)是與Marker和目的蛋白對應(yīng)性好，同時(shí)在同張片上顯示，不用拼接，利于分析。缺點(diǎn)是如果樣品中帶有生物素背景，那個(gè)抗生物素抗體有可能影響結(jié)果，而且反應(yīng)體系太過復(fù)雜也會干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

②特殊標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)

在經(jīng)過修飾的蛋白標(biāo)準(zhǔn)中，除了生物素標(biāo)記以外，近些年由于下游蛋白操作的豐富化與復(fù)雜化，也出現(xiàn)帶有“尾巴”的蛋白標(biāo)準(zhǔn)。比如His-Tag，如果每個(gè)Marker條帶都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結(jié)果上。很方便，問題就是有可能有潛在的干擾，比如樣品中正好有類似Histag的結(jié)構(gòu)。不過這可以通過對照檢測的。