portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">生物分子下游純化的對(duì)象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測(cè)定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過實(shí)驗(yàn)選擇出/有效的純化流程。

測(cè)定——分子量、PI

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時(shí)，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y(cè)定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測(cè)定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個(gè)含不同PH緩沖液的試管中，可簡(jiǎn)易地測(cè)出PI，并選擇純化用緩沖液的佳PH。

選擇——層析方法

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">若對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">1. 使用/通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將 樣品分成不同組份。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">2.用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">3. 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。

純化——大量粗品

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAmlINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。

純化——硫酸氨樣品

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇/適合介質(zhì)及佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。

純水——糖類分子

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組份、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。

純化——膜蛋白

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時(shí)和目標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。

純化——單抗、抗原

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">單抗多為IgG。來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對(duì)IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白A介質(zhì) Mabselect和rProtein A Sepharose FF對(duì)IgG有高的載量和專一性，基團(tuán)脫落少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">純化IgG抗原/有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">HiTrap IgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結(jié)合量達(dá)100mg純IgY。

純化——重組蛋白

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAmlINE便很適合做粗分離。 Amersham biosciences提供三個(gè)快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱/甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血/酶或因子Xa切開。

portant;="" white-space:="" orphans:="" 2;="" widows:="" background-color:="" rgb(255,="" 255,="" 255);="" font-variant-ligatures:="" font-variant-caps:="" -webkit-text-stroke-width:="" text-decoration-thickness:="" initial;="" text-decoration-style:="" text-decoration-color:="" initial;"="">蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。