細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及細(xì)胞均勻鋪板技巧詳解

  細(xì)胞凍存：

  1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：細(xì)胞室及工作臺(tái)紫外線照射15min;培養(yǎng)液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒溫水浴箱37℃預(yù)熱備用;收集對數(shù)生長期細(xì)胞，在凍存前一天換液

  2.用吸管吸出培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2遍吸出沖洗液，加入適量胰蛋白酶消化。

  3. 適時(shí)去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。

  4. 用吸管將培養(yǎng)液加入凍存管中，離心(1000r/min，10分鐘)。

  5. 去上清液，加入與細(xì)胞懸液等量的凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻

  6. 冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16～18小時(shí)(或隔夜)---液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1h，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

  7.記錄每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

  細(xì)胞復(fù)蘇

  室內(nèi)紫外消毒;培養(yǎng)基、PBS于37℃恒溫水浴預(yù)熱備用。

  自液氮罐中取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，離心。

  去上清，加入培養(yǎng)基，吹打，然后移入培養(yǎng)瓶中，用培養(yǎng)基清洗凍存管，清洗液也移入培養(yǎng)瓶中。

  于培養(yǎng)瓶中加入適量培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

  記錄復(fù)蘇日期;次日換液。

  細(xì)胞均勻鋪板技巧：

  1、一般96孔板,每孔是加100微升細(xì)胞懸液，從孔的左邊靠近底部加入，加完半邊板后，將未加的細(xì)胞懸液混一下再，繼續(xù)加剩余的半邊板子，都加完后蓋上蓋子，左手輕輕扶住板的左邊，右手輕輕敲擊板的右邊緣，注意把握力度，太強(qiáng)或次數(shù)太多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞集中成堆，將板順時(shí)針旋轉(zhuǎn)(逆時(shí)針效果不好)，依次敲擊剩余三個(gè)邊，靜置約5分鐘，放入37度培養(yǎng)箱。

  6孔板12孔板或24孔板，均采用將個(gè)孔加入少量無血清培養(yǎng)基，晃動(dòng)浸潤整個(gè)孔底，然后用移液槍吸至第二孔，同樣方法浸潤孔底，其它孔一次類推，這樣整個(gè)孔底都是濕潤的，細(xì)胞懸液會(huì)平鋪在整個(gè)孔底，加細(xì)胞懸液的時(shí)候可以避免加在中間中間細(xì)胞多，而加在周邊晃勻后周邊細(xì)胞多中間少的現(xiàn)象，細(xì)胞分散較均勻，注意加完細(xì)胞懸液后要放工作臺(tái)靜置一下。

  2、細(xì)胞懸液加完后，將細(xì)胞培養(yǎng)板抬高，對著燈光，從底部往上看，看細(xì)胞有沒有抱團(tuán)。然后從底部敲擊，使之分散。

  3、如果實(shí)驗(yàn)室有平板振蕩器的話，建議用這個(gè)儀器稍振蕩一下，效果不錯(cuò)，就是振幅小，頻率高的那種。

  4、細(xì)胞要盡量打散，大部分呈單個(gè)狀態(tài)。離心后，要充分懸浮!還有轉(zhuǎn)移到六孔板后，是要晃得!晃的時(shí)候不要讓那個(gè)細(xì)胞液轉(zhuǎn)圈，不然細(xì)胞就全被帶到中間去了，就會(huì)不均勻!

  5、一瓶細(xì)胞長滿后，正常處理，在培養(yǎng)瓶里吹勻，然后鋪6孔板，每孔2毫升，鋪完之后不用觀察直接用酒精棉擦拭，然后放到培養(yǎng)箱里，輕微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈?；旧?4小時(shí)之后觀察 每孔的細(xì)胞都會(huì)很均勻。

  6、計(jì)算好所需要的全部液體量和細(xì)胞量，混勻后，加到六孔板里，六孔板按橫8字型晃，顯微鏡下觀察，如果不均勻，按上述方法再晃。如果細(xì)胞未計(jì)數(shù)直接種的話，在種六孔板的過程中，隨時(shí)晃一下混勻用的瓶子，瓶子我通常是順時(shí)針或逆時(shí)針轉(zhuǎn)圈。

  7、放在水平板面上先上下移動(dòng)，再左右移動(dòng)，每個(gè)方向5到6次，但關(guān)鍵的是搖完后直接放入培養(yǎng)箱中，不要再做過多的運(yùn)動(dòng)，例如放到鏡下去看，否則很容易就又聚到中間去了。

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