古朵分享：溶菌酶的性質(zhì)及制備方法有哪些?

  溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種能水解細菌中黏多糖的堿性酶。溶菌酶主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復合體，使病毒失活。 該酶廣泛存在于人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、乳汁等液體，以及微生物也含此酶，其中以蛋清含量為豐富。 其中根據(jù)其來源的不同，可以將其分為四類，分別是植物溶菌酶、動物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。

  性質(zhì)：

  1、溶菌酶純品呈白色、微黃或黃色的結(jié)晶體或無定形粉末，無異味，微甜，易溶于水，不溶于丙酮。溶菌酶遇堿易被破壞，但在酸性環(huán)境下，溶菌酶對熱的穩(wěn)定性很強，在pH值為4-7時，100℃處理1min，仍能較好地保持活力:pH值為3時，能耐100℃加熱處理45min。

  2、溶菌酶化學性質(zhì)非常穩(wěn)定，當pH值在一定范圍內(nèi)劇烈變化時，其結(jié)構(gòu)幾乎不變。溶菌酶不可逆變性的臨界點是77℃，隨溶劑的變化，不可逆變性臨界點也發(fā)生變化，當溶菌酶所處溶液pH值小于1時，不可逆變性臨界點降低到43℃。

  3、溶菌酶適pH為5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐; 溶菌酶作為防腐劑安全性高，可被冷凍或干燥處理，且活力穩(wěn)定。

  4、溶菌酶對幾種變性劑的敏感程度為:二惡烷>二甲基乙酰胺>二甲基甲酰胺>丙酮，并且隨溶劑用量的增加而直線下降。

  制備方法：

  目前溶菌酶可以以雞蛋清和蛋殼膜為材料提取制得，常用的方法有親和層析法、離子交換樹脂法、直接結(jié)晶法和聚丙烯酸沉淀法等。

  1、親和層析法

  親和層析法是利用蛋白質(zhì)和酶的生物學特異性，即蛋白質(zhì)或酶與其配體之間所具有的專一性親和力而設(shè)計的色譜技術(shù)。酶一底物復合物形成之后，在一定的條件下分離復合物便得到純凈的酶。常常使用的吸附劑為幾丁質(zhì)及其衍生物，如：幾丁質(zhì)粉、羧甲基幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)包埋纖維素、脫氨幾丁質(zhì)粉、N-?；瘹ぞ厶?、脫氨再生幾丁質(zhì)凝膠。

  2、離子交換樹脂法

  離子交換法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所生的交換反應(yīng)來進行分離的，分離的效果較好，廣泛用于微量組分的富集。一般流程為：鮮蛋一預處理一攪拌吸附一上柱洗脫一等電點沉淀一透析一噴霧干燥一成品。

  溶菌酶在等電點以下較廣泛的pH值范圍內(nèi)，分子帶正電荷，可吸附于弱酸性陽離子交換樹脂上，洗脫后鹽析，可得溶菌酶沉淀，再進行精制可得成品。蛋清吸附724樹脂，洗滌緩沖液洗脫，硫酸銨溶液鹽析透析，用NaOH去堿性蛋白，凍干溶菌酶，凍干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，將新鮮蛋清540kg加入到已處理好的80kg 724樹脂中，攪拌吸附6h，在0—5℃靜置過夜。傾出上層蛋清，樹脂離心甩干，用蒸餾水反復洗去黏附的卵蛋白，然后將樹脂裝入柱內(nèi)，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸緩沖溶液約150L洗滌樹脂，再用約600L的10%硫酸銨溶液洗脫，收集洗脫液。洗脫液中加硫酸銨，使終含硫酸銨量為40%，有白色沉淀生成，冷處放置過夜。虹吸上層清液，沉淀吸濾抽干，再用1倍蒸餾水溶解沉淀呈稀糊狀，然后裝入透析袋，在約5℃的條件下，對蒸餾水透析24h左右，中間換水2—3次。離心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液與離心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氫氧化na溶液，同時不斷攪拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即離心除去。然后用3mol/L鹽酸調(diào)pH=5.0，冷凍干燥，即得白色片狀溶菌酶。也可將離心液用3mol/L鹽酸調(diào)pH=3.5，在攪拌下緩慢加入5%的固體氯化鈉，在約5℃的溫度下靜置48h，離心，沉淀用0℃丙酮洗滌，干燥，即得溶菌酶。

  3、食鹽直接結(jié)晶法

  在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸鹽等鹽類，并調(diào)pH值至9.5—10.0，溶菌酶會以結(jié)晶形式慢慢析出，而大多數(shù)蛋白質(zhì)仍然在溶液。在超濾濃縮脫鹽后，為獲得較純產(chǎn)品，采用結(jié)晶純化酶液經(jīng)超濾處理后，用NaOH調(diào)整pH 9.5，離心去除。上清液在緩緩攪拌下，加NaCl至5%，靜置一周，得粗結(jié)晶。結(jié)晶溶于pH 4.6醋酸水中，分去不溶物后，進行重結(jié)晶，結(jié)晶的終得率為60%左右。即每公斤蛋清中可得重結(jié)晶品近1.3 g，活力測定為8000U/mg。

  4、聚丙烯酸沉淀法

  聚丙烯酸沉淀法為將提取過濾后含酶洗脫液，首先經(jīng)過吸附步驟，即將過濾后的澄清溶液用20%的NaOH溶液調(diào)pH至6.0，在調(diào)pH值的過程中不停的攪拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值為3.0為止，靜置17個小時進行靜析，得到粘附于底部的乳白色膠狀物。第二步解離，將前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸餾水并用0.5 mol/L的碳酸鈉，將其溶解，轉(zhuǎn)移后，將pH值調(diào)到9.5。加入5%CaCl2溶液將溶菌酶聚丙烯酸解離，至無沉淀析出，然后過濾，得到澄清溶液。第三步鹽析，將所得澄清溶液加入5%的NaCI溶液攪拌均勻。放入冰箱調(diào)溫度為0℃。待有晶體析出后，用無水乙醇洗滌數(shù)次，置恒溫培養(yǎng)箱中40℃條件下干燥稱重。

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