古朵實驗干貨—Western Blot原理、顯色分類及主要試劑

  (1) 原理

  與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯/酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針"是抗體，“顯色"用標記的二抗。

  經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。

  以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

  (2) 分類

  western顯色的方法主要有以下幾種：

  i.放射自顯影

  ii.底物化學發(fā)光ECL

  iii.底物熒光ECF

  iv.底物DAB呈色

  現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下(二抗用HRP標記)：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

  (3) 主要試劑

  1、丙烯/酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀/酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀/酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯/酰胺儲存液丙稀/酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀/酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。

  2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。

  3、分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。

  4、濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。

  5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙2胺催化過硫/酸銨形成自由基而加速兩種丙稀/酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀/酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.

  6、SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。

  7、Tris-甘/氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘/氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘/氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。

  8、轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘/氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。

  9、麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯yi酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。

  10、脫脂奶粉5%(w/v)。

  11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。

  12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

  13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

  14、過氧化物酶標記的第二抗體。

  15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

  16、BCIP(溶于二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

  17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

  18、100mmol/L NaCl。

  19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。

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