單克隆抗體制備實驗失敗原因分析

  由于制備單克隆抗體的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

  其主要失敗原因和影響因素有：

  1、污染

  包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是單克隆抗體制備工作中zui辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于 BALB/c 小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

  2、融合后雜交瘤不生長

  在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

  (1)牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴格篩選;

  (2)HAT 有問題，主要是 A 含量過高或 HT 含量不足;

  (3)骨髓瘤細胞污染了支原體;

  (4) EG 有毒性或作用時間過長。

  3、雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

  融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是 HAT 中 A 失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成 A 抵抗細胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?，可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。之前提出的“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

  三要：

  要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

  要應用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。

  要定期進行再克隆。

  三不要：

  不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

  不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

  不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

  4、雜交瘤細胞難以克隆化

  可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養(yǎng)液加 HT

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