古朵生物：抗體的制備方法和原理：抗血清的制備

  一、用于免疫的動(dòng)物

  作免疫用的動(dòng)物有哺乳類(lèi)和禽類(lèi)，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類(lèi)的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡，健壯，無(wú)感染性疾患，為///雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

  二、免疫途徑

  免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

  三、佐劑

  由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱(chēng)為免疫佐劑。

  佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。

  常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant)，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9(V/V)，這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑。

  配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液(其中加卡介苗3～4mg/ml或不加)，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來(lái)回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

  四、免疫方法

  抗原劑量，劑量為300～500μg，加強(qiáng)免疫的劑量約為劑量為1/4左右。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不*佐劑，免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗。

  在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)(見(jiàn)后)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿(mǎn)意時(shí)為止(圖2-3)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

  五、抗血清的采集與保存

  家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血，鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱(籠)外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開(kāi)動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔臺(tái)，剪去頸部的毛，切開(kāi)皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過(guò)程中要嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。

  收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過(guò)夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm，10min。在無(wú)菌條件，吸出血清，分裝(0.05～0.2ml)，貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

  六、抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

  在免疫期間，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作*的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。

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