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課堂小知識:免疫熒光染色及注意事項
發(fā)布時間:2023-07-26瀏覽次數(shù):819返回列表
課堂小知識:免疫熒光染色及注意事項
免疫熒光染色:
(1)冰凍切片用0. 01 moUL PBST(或PBS)漂洗或沖洗3次,每次5min。
(2) 3% H2O2孵育10min,再用0. 01 mol/L PBS沖洗3次,每次5 min。
(3) 5%一8%的正常動物血清(山羊或馬血清)孵育30-60min。
(4)洗掉血清,滴加一抗(0. 01 mol/L PBS配制),4℃過夜。
(5)吸出一抗,0. 01 mol/L PBS沖洗3次,每次5 min,加入熒光標記的二抗(0. 01 mol/L PBS配制),4℃過夜。
(6)吸出二抗,0. 01 mol/L PBS沖洗3次,每次 10min。
(7)封片劑封片,熒光顯微鏡觀察照相。
注意事項:
(1) 由于熒光容易淬滅,一般僅能維持幾個小時,因此,熒光二抗應避光保存,即從加入熒光二抗以后的步驟中都要盡量避光操作。封片后應盡早照相,目前有市售的熒光增強劑,可使熒光在4℃保存1-2周仍不淬滅。
(2) 常用的熒光素有以下幾種,綠色熒光:FITC、 Alexa Fluor 488和GFP;紅色熒光:TRITC、Cy3、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed;藍色熒光:Hoechst、DAPI;黃色熒光:YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23等。
(3)不同的熒光素激發(fā)的波長不同,因此,選用濾光片時要注意。一般紫外線的激發(fā)波長為334-365nm,藍光的激發(fā)波長為435-490nm,綠光的激發(fā)波長為546nm左右。
(4) 熒光顯微鏡應提前至少15 min打開汞燈預熱。關閉30min后方可再開啟。
(5)免疫熒光的組織要求很高,載玻片及蓋玻片要干凈無雜質。進行熒光染色時,需注意染液的pH、濃度和染色溫度,還要避免對熒光有熄滅作用的物質的接觸。組織和細胞也有自發(fā)熒光,如紅細胞中的血紅蛋白呈紅色熒光,維生素A呈綠色自發(fā)性熒光等。
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