技術(shù)分享：多重?zé)晒饷庖呓M化--TSA技術(shù)

  基于酪胺信號(hào)放大(TSA)技術(shù)，多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC)利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)樣本中多種蛋白標(biāo)志物進(jìn)行染色標(biāo)記，古朵生物,實(shí)現(xiàn)在同一組織切片上多個(gè)靶標(biāo)蛋白共同染色(多可實(shí)現(xiàn)數(shù)十種蛋白的共染色)，從而通過(guò)熒光圖像分析挖掘組織微環(huán)境中的復(fù)雜信息，如定量分析、共表達(dá)確定細(xì)胞分型、空間關(guān)系分析等等。

  一、技術(shù)原理

  酪酰胺信號(hào)放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類(lèi)利用辣根過(guò)氧化酶(HRP)對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測(cè)方法。熒光標(biāo)記的酪胺分子在H2O2環(huán)境下被二抗標(biāo)記的HRP催化激活，產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng)，使熒光素在抗原-抗體結(jié)合部位與組織周?chē)牡鞍讱埢Y(jié)合，形成大量的熒光素沉積，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

  TSA技術(shù)原理是熒光染料與抗原直接結(jié)合，通過(guò)熱處理或微波處理可洗脫一抗和二抗并同時(shí)保留與組織抗原共價(jià)結(jié)合的熒光素。古朵生物，因此可以通過(guò)使用不同的偶聯(lián)染料多次循環(huán)實(shí)驗(yàn)對(duì)多種蛋白抗原進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)一張組織切片上多個(gè)蛋白的共染色。

  二、優(yōu)勢(shì)

  ①TSA技術(shù)可使熒光放大信號(hào)大幅增強(qiáng)，大約是普通熒光的3~10倍。

  ②一抗抗體的種屬來(lái)源不限。

  普通熒光免疫組化共染的不同靶標(biāo)要求一抗抗體是不同的種屬來(lái)源，而TSA技術(shù)每一輪染色后可以把上一輪的一抗和二抗洗掉，對(duì)后一輪染色無(wú)影響，因此同一種屬來(lái)源的一抗并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  ③實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需嚴(yán)格避光，因熒光素穩(wěn)定不容易淬滅，米徠迪生物，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中即使沒(méi)有避光也不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且染色后的玻片可以保存數(shù)月不淬滅，仍可以重新掃描。

  三、實(shí)驗(yàn)步驟

  1.脫蠟和水化

  將切片組織依次放入烘箱內(nèi)烤片1h→二jia 苯Ⅰ15min→二jia苯Ⅱ15min→無(wú)水乙醇Ⅰ5min→無(wú)水乙醇Ⅱ

  2.抗原修復(fù)

  根據(jù)一抗選擇合適的修復(fù)液(酸性的檸檬酸鈉緩沖液或堿性的Tris-EDTA緩沖液)，米徠迪生物，將切片組織浸沒(méi)于修復(fù)液中加熱至沸騰，中低火維持20 min，自然冷卻至室溫。

  3.阻斷過(guò)氧化物酶

  用PBS洗滌三次，每次4 min。切片組織放入3%過(guò)氧化氫水溶液中，孵育15 min。用PBS洗滌三次，每次4 min。

  4.封閉

  在組織周?chē)?huà)阻水圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)加入血清封閉 10min。

  5.一抗孵育

  輕輕甩去封閉液，在圈內(nèi)滴加一抗工作液覆蓋組織，米徠迪生物，于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜或者 37℃ 1~2h。

  6.二抗孵育

  用PBS洗滌三次，每次4 min。圈內(nèi)加入配置好的HRP標(biāo)記二抗(與一抗相應(yīng)種屬)，避光室溫孵育30min。

  7. TSA熒光染料反應(yīng)

  用PBS洗滌三次，每次4 min。米徠迪生物，圈內(nèi)滴加TSA工作液孵育10min。PBS洗滌三次，每次4 min。

  8、重復(fù) 2-7 步驟(選擇對(duì)應(yīng)的TSA熒光染料)

  9、DAPI 細(xì)胞核染色

  PBS洗滌三次，每次4 min。米徠迪生物，圈內(nèi)滴加DAPI抗淬滅染液孵育10min。

  10、 封片

  PBS洗滌三次，每次4 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

  11、使用熒光掃描儀對(duì)玻片組織進(jìn)行全景掃描

  四、注意事項(xiàng)

  ①染料充分溶解混勻，有的試劑盒是有機(jī)溶性，如有沉淀，一定要先過(guò)濾。

  ②實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免切片干燥，并注意避光。米徠迪生物，

  ③選擇特異性高的一抗抗體。

  ④表達(dá)高的一抗搭配弱光，表達(dá)低的搭配強(qiáng)光。米徠迪生物，

  ⑤實(shí)驗(yàn)前做好方案設(shè)計(jì)，確定好染色順序、修復(fù)條件，以及每個(gè)抗體搭配的熒光染料。

  多重?zé)晒饷庖呓M化--TSA技術(shù) 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專(zhuān)門(mén)從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷(xiāo)售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷(xiāo)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿(mǎn)足客戶(hù)的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶(hù)需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶(hù)滿(mǎn)意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。