古朵技術(shù)教您一次學(xué)會(huì)免疫熒光抗體的選擇小技巧

  一、根據(jù)樣本選擇一抗：

  一抗選擇需滿足IF應(yīng)用，一抗種屬應(yīng)盡量選擇與檢測(cè)樣本不同來(lái)源，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

  舉例：檢測(cè)小鼠樣本，則盡量避免選擇小鼠或大鼠源的一抗(如果選了同種屬一抗建議加個(gè)同型對(duì)照)，好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測(cè)分子(熒光素、生物素等)的抗兔IgG。

  二、根據(jù)一抗種屬選擇二抗：

  根據(jù)一抗類型與亞型：如果一抗是IgM，就選擇抗IgM二抗。

  二抗的類型：細(xì)胞或組織表達(dá)Fc受體較高，全長(zhǎng)二抗的Fc端容易與Fc受體結(jié)合，選擇F(ab)2片段抗體避免非特異性結(jié)合。

  二抗的純化方式：經(jīng)交叉吸附處理的二抗在純化后再次通過(guò)固定了其他種屬的血清或抗體的純化柱，降低種屬間交叉反應(yīng)，在多色分析具有突出的優(yōu)勢(shì)。

  熒光基團(tuán)：選擇光譜不重疊且穩(wěn)定明亮的熒光基團(tuán);顏色搭配時(shí)也要適當(dāng)考慮強(qiáng)弱搭配。

  3大技巧：

  對(duì)于多色分析，原則上一抗盡量來(lái)源于不同種屬，且熒光標(biāo)記二抗與一抗的種屬要匹配，避免二抗發(fā)生交叉反應(yīng);兩種抗體熒光素的光譜重疊效應(yīng)應(yīng)小。

  實(shí)驗(yàn)前好先驗(yàn)證單標(biāo)對(duì)特定組織或細(xì)胞是否有效，再進(jìn)行多標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

  如果采用TSA技術(shù)，則不需要考慮一抗種屬來(lái)源問(wèn)題

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