知識詳解：細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解答

  1. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

  培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始。

  2. 何時須換培養(yǎng)基?

  視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的換時間，按時換培養(yǎng)基即可。

  3. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基?

  不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

  4. 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類?

  不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。

  5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

  FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

  6. 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?

  一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時，則應(yīng)使用5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

  7.Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?

  HBS和EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

  8. 什么是細(xì)胞的接種密度?

  依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。

  9. 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?

  一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞的培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

  10. 冷凍管應(yīng)如何解凍?

  取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。

  11. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO?

  除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞)，在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15 ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題。

  12. 附著性細(xì)胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

  一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會。

  13. 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

  回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

  14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何?

  動物細(xì)胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

  15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?

  冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜。

  16. 冷凍保存細(xì)胞的方法?

  冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

  冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

  17. 細(xì)胞欲冷凍保存時， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?

  冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

  18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

  除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

  19. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?

  細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的**方法。當(dāng)然，適當(dāng)添加抗生素也是防止細(xì)胞污染的途徑，Invivogen公司就能提供多種細(xì)胞抗生素類產(chǎn)品：

  Primocin?——原代細(xì)胞抗生素

  Primocin?是專門設(shè)計用于保護(hù)原代細(xì)胞免受微生物污染的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體和真菌均有殺傷作用。Primocin?對原代細(xì)胞沒有毒性，因為其作用的靶標(biāo)只存在于微生物上。其中細(xì)菌的靶標(biāo)為DNA解旋酶和原核細(xì)胞核糖體亞基30S和50S;真菌的靶標(biāo)為麥角固醇(一種只發(fā)現(xiàn)于真菌和酵母細(xì)胞膜的分子)。Primocin?的推薦使用濃度為100 mg/ml,無需添加青霉素/鏈霉素。

  產(chǎn)品名稱

  規(guī)格

  產(chǎn)品編號

  Primocin?

  500 mg (10 x 1 ml)

  ant-pm-1

  1 g (1 x 20 ml)

  ant-pm-2

  Normocin?——細(xì)菌、真菌、支原體多效抗生素

  Normocin?具有抗細(xì)菌、真菌、支原體三種微生物的作用，其包含兩種成分可通過阻斷DNA復(fù)制和蛋白合成來殺滅細(xì)菌和支原體。第三種成分通過干擾細(xì)胞膜離子交換來清除酵母和真菌。Normocin?推薦使用濃度為100 mg/ml，該濃度對細(xì)胞沒有毒性。此外，如果與青霉素/鏈霉素合用，可以增加抗菌譜。

  產(chǎn)品名稱  規(guī)格  產(chǎn)品編號

  Normocin?

  500 mg (10 x 1 ml)

  ant-nr-1

  1 g (1 x 20 ml) ant-nr-2

  Fungin?——真菌特異性抗生素

  Fungin?是Pimaricin(匹馬菌素)的可溶性形式，Pimaricin是十九世紀(jì)五十年代發(fā)現(xiàn)的多烯抗真菌試劑，可通過干擾細(xì)胞膜離子交換的方式殺滅酵母、霉菌和真菌。Fungin?十分穩(wěn)定，在37°C放置6天仍具有活性。與Amphotericin B(兩性霉素B)需要溶于有毒的脫氧膽酸鹽不同，F(xiàn)ungin?是水溶性的，對細(xì)胞性，并且不會影響細(xì)胞代謝，推薦使用濃度為10 mg/ml - 50 mg/ml。

  產(chǎn)品名稱  規(guī)格  產(chǎn)品編號

  Fungin?

  75 mg (5 x 1.5 ml)

  ant-fn-1

  200 mg (1 x 20 ml) ant-fn-2

  20. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理?

  原則上：直接滅菌后丟棄之。

  當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

  高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

  (1) 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

  (2) 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

  (3) 每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

  (4) 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。

  (5) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

  (6) 重復(fù)步驟4。

  (7) 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

  21. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

  不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。

  22. 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?

  支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長參數(shù)，代謝及研究的任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。

  23. 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理?

  直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染

  Plasmocin?——支原體預(yù)防與去除利器

  Plasmocin?是目前全球*受科研工作者歡迎的支原體抗生素之一。其包含大環(huán)內(nèi)酯物及對苯二酚兩種主要成分，可有效作用于支原體復(fù)制的蛋白合成階段和DNA復(fù)制階段，只需兩周即可清除支原體污染，并且不會影響細(xì)胞本身代謝;其特有的轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以將有效成分轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，故對胞內(nèi)支原體和胞外游離的支原體都十分有效。此外，低濃度的Plasmocin?對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌也有一定的清除作用。

  Plasmocin? Treatment (ant-mpt)

  用于清除支原體污染，使用濃度為25 ug/ml,2周即可徹底清除支原體。

  Plasmocin? Prophylactic (ant-mpp)

  用于預(yù)防支原體污染，定期添加于細(xì)胞培養(yǎng)基中，使用濃度為2.5 - 5 ug/ml。

  產(chǎn)品名稱  規(guī)格  產(chǎn)品編號

  Plasmocin? treatment

  50 mg (2 x 1 ml)

  ant-mpt

  Plasmocin? prophylactic

  25 mg (10 x 1 ml)

  ant-mpp

  Plasmocure?——強(qiáng)力清除具有Plasmocin?抗性的支原體

  據(jù)報道在極少數(shù)情況下，有些支原體對Plasmocin? 具有抗性。基于此，InvivoGen又開發(fā)了第二款支原體抗生素Plasmocure?。Plasmocure?采用不同于Plasmocin?作用機(jī)制的兩種抗生素來殺滅支原體，處理兩周時間即可徹底清除這些頑固支原體。在處理過程中有輕度的細(xì)胞毒性，但支原體清除后細(xì)胞系可完全恢復(fù)。Plasmocure?推薦使用濃度為50 mg/ml。

  產(chǎn)品名稱  規(guī)格  產(chǎn)品編號

  Plasmocure?

  100 mg (1 x 1 ml)

  ant-pc

  24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔?

  定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水換之。

  25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性?

  培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2， 以調(diào)整pH 值。

  26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同?

  不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異。

  27. 購買的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形?

  研究人員在冷凍細(xì)胞的培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再換培養(yǎng)基即可。

  28. 購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

  研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于-80℃太久。

  29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

  我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

  (1) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

  (2) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

  (3) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

  (4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

  (5) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

  30. L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?

  L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

  31. GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定?

  GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

  GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

  32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

  酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，不用加。

  培養(yǎng)基 血清 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒