導(dǎo)讀：對(duì)于PCR反應(yīng)來說重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性。本文帶你了解一下PCR儀溫度控制的準(zhǔn)確性有多強(qiáng)大。

 

          PCR是一個(gè)幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增的過程，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對(duì)退火而言溫控顯得尤為重要。有時(shí)，退火溫度相差1ºC，就能帶來迥然不同的結(jié)果。目前，市場(chǎng)上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準(zhǔn)確性在±0.2ºC左右。

 

　　溫度控制算法的性無(wú)疑會(huì)影響溫度控制的。前面提到的模塊熱過沖，需要非常豐富的經(jīng)驗(yàn)，的算法才可使不同體積的樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點(diǎn)溫度且無(wú)過沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)。

 

　　對(duì)于96孔板PCR儀來說，另一個(gè)重要的參數(shù)是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴(kuò)增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那么我們自然無(wú)法通過比較兩個(gè)不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù)，而得到可靠的結(jié)論。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5ºC之間。

 

　　對(duì)于梯度PCR而言，溫度準(zhǔn)確性的要求似乎高。通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次反應(yīng)就可以篩選出適合的退火溫度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。

 

　　傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個(gè)Peltier元件組成，對(duì)它們?cè)O(shè)置不同的溫度，通過熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度。不過，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學(xué)相互作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正的線性梯度。實(shí)際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實(shí)退火溫度，尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗(yàn)時(shí)。

 

　　萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司在這方面就有獨(dú)到的設(shè)計(jì)，它的加熱模塊有多有6個(gè)的加熱/冷卻模塊，由溫度控制器單獨(dú)控制。各個(gè)Peltier模塊之間用隔熱材料進(jìn)行物理隔離，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾小化，溫度控制加。VeriFlex技術(shù)可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致，確保優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件在隨后的日常運(yùn)行中也表現(xiàn)出一致的結(jié)果。

 

　　研究人員的另一個(gè)噩夢(mèng)是PCR反應(yīng)會(huì)蒸發(fā)。這種蒸發(fā)現(xiàn)象使PCR反應(yīng)體系中各組分濃度升高，特別是引物濃度升高，直接導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。E萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司梯度PCR儀則采用vapo.protect技術(shù)，防止PCR反應(yīng)體系的蒸發(fā)。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材，各種不同形狀的PCR耗材都能實(shí)現(xiàn)覆蓋。這種技術(shù)提高了結(jié)果的重復(fù)性，是小體積擴(kuò)增的理想之選。
 

　　Applied Biosystems則是通過熱蓋的自動(dòng)調(diào)節(jié)和凹形設(shè)計(jì)確保PCR管的密封，基本上市場(chǎng)面上常見的PCR耗材都可以使用。當(dāng)然，通常廠家會(huì)建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材，畢竟是經(jīng)過廠家多重測(cè)試的，肯定也不會(huì)錯(cuò)。