細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

  具體操作:

1、實驗前準(zhǔn)備：

  1）.將水浴鍋預(yù)熱至37℃

  2）.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

  3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

2、取出凍存管：

  1）.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

  2）.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。

3、迅速解凍：

  1）.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

  2）.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

4、平衡離心：

  用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min

5、制備細(xì)胞懸液：

  1）.吸棄上清液。

  2）.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

6、細(xì)胞計數(shù)：

  細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

7、培養(yǎng)細(xì)胞

  將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。

易犯錯誤：

  1)、水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

  2）、水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。

  3）、離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

  4）、一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。