素爾生物2018春季血清大促銷 WB標(biāo)準(zhǔn)protocol
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素爾生物2018春季血清大促銷 WB標(biāo)準(zhǔn)protocol
素爾生物2018春季血清大促銷，成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
1凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析
2吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析
3處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
4處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測
素爾生物2018春季血清大促銷，成功進(jìn)行WB檢測，則設(shè)置合適正確的對照是必不可少的，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對照如下：
l 陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率
l 陰性對照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的特異性
l 二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
l 內(nèi)參對照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
l 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果
素爾生物2018春季血清大促銷，WB檢測基本過程
1、獲取細(xì)胞或組織裂解物
1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
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蛋白位置 |
推薦buffer |
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全細(xì)胞 |
NP-40 or RIPA |
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胞漿（可溶性蛋白） |
Tris-HCl |
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胞漿（骨架結(jié)合蛋白） |
Tris-Triton |
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膜蛋白 |
NP-40 or RIPA |
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核蛋白 |
RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
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線粒體蛋白 |
RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay,Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質(zhì)
素爾生物2018春季血清大促銷，根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
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待測蛋白狀態(tài) |
凝膠條件 |
上樣buffer |
電泳buffer |
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Reduced - Denatured |
還原，變性 |
含β-巰基乙醇或DTT，含SDS |
含SDS |
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Reduced - Native |
還原，不變性 |
含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS |
不含SDS |
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Oxidized - Denatured |
不還原，變性 |
不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS |
含SDS |
|
Oxidized - Native |
不還原，不變性 |
不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS |
不含SDS |
根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
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蛋白分子量（kDa） |
凝膠濃度（％） |
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4-40 |
20 |
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12-45 |
15 |
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10-70 |
12.5 |
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15-100 |
10 |
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25-200 |
8 |
4、轉(zhuǎn)膜
根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性，選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
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PVDF膜 |
NC膜 |
尼龍膜 |
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靈敏度和分辨率 |
高 |
高 |
高 |
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背景 |
低 |
低 |
較高 |
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蛋白結(jié)合能力 |
100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結(jié)合） |
80-100ug/cm2 |
>400ug/cm2 |
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機械強度 |
強 |
干的膜易脆 |
軟而結(jié)實 |
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溶劑抗性 |
強 |
差 |
差 |
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使用前是否需要浸潤 |
甲醛潤濕 |
緩沖液潤濕 |
緩沖液潤濕 |
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適用染色方法 |
膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 |
膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 |
不能用陰離子染料 |
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適用檢測方法 |
顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測 |
顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性 |
顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性 |
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適用范圍 |
普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質(zhì)測序、氨基酸分析、重復(fù)檢測 |
普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 |
低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
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價格 |
高 |
較低 |
低 |
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
l 選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗證）
l 選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
l 選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
l 根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。
l 抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周
l 根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進(jìn)行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索佳稀釋度（1:100-1:3000）。
l 孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別
7、二抗孵育
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行多個稀釋比例進(jìn)行摸索佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8、底物孵育
選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
9、結(jié)果分析和檢測
凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進(jìn)行洗滌，3次，每次5min
素爾生物2018春季血清大促銷，WB技術(shù)要點和常見問題分析
WB過程中常見的問題及可能原因分析
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問題 |
可能原因 |
驗證或解決辦法 |
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轉(zhuǎn)膜不充分 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用 methanol浸透膜 |
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靶蛋白分子量小于10,000 |
選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間 |
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靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值 |
可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 |
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甲醇濃度過高 |
過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 |
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轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel |
對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間 |
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背景高 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用 methanol浸透膜 |
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洗膜不充分 |
增加洗液體積和洗滌次數(shù) |
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阻斷不充分 |
增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） |
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二抗?jié)舛冗^高 |
降低二抗?jié)舛?/span> |
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檢測過程中膜干燥 |
保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象 |
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曝光過度 |
縮短曝光時間 |
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抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) |
檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) |
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沒有陽性條帶 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時間 |
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酶失活 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 |
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試劑不匹配 |
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性 |
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一抗失效 |
選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊N化Na |
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有陽性條帶，但條帶比較弱 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時間 |
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酶活性降低 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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標(biāo)本中靶蛋白含量太低 |
增加標(biāo)本上樣量。 |
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洗膜過度 |
縮短洗滌時間 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊N化Na |
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抗體活性降低 |
選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置 |
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蛋白轉(zhuǎn)移不充分 |
見上述 |
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封閉過度 |
減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 |
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曝光時間過短 |
延長曝光時間 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊N化Na |
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條帶位置（大?。┎粚?；或有非特異性條帶 |
二抗的非特異性結(jié)合 |
增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
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一抗的特異性不夠 |
使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 |
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蛋白降解 |
使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑 |
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二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 |
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抗體濃度過高 |
降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 |
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蛋白上樣量過大 |
降低上樣量 |
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背景有斑點 |
封閉劑中有聚集體 |
使用前過濾封閉試劑 |
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HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 |
過濾二抗試劑，去除聚集體 |
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膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶） |
HRP含量過高 |
降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
