HR8272 線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE法)

線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE法)TMRE比羅丹明123更快地穿過質膜,并且它們的強熒光允許使用低探針濃度,從而避免聚集。由于它們的熒光對環(huán)境相對不敏感,因此TMRE的空間分辨熒光呈現(xiàn)其跨膜分布的無偏分布,TMRE已成功用于高分辨率對于影響活細胞中線粒體膜電位的藥物的高通量篩選測定。

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線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE法)

 

產品編號：HR8272

產品組成：

儲存條件：

TMRE -20℃避光保存,避免反復凍融。稀釋液2-8℃保存。有效期6個月。

【注】：

● TMRE染色液需要長期保存時可以根據(jù)使用情況進行小量分裝后-20℃保存。

● 染色液A為DMSO溶液,冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài),極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預熱,否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

產品簡介：

線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE)是利用TMRE探針檢測線粒體膜電位的試劑盒,可以快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化,可以用于早期的細胞凋亡檢測。

線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。TMRE是一種可通透細胞膜的選擇性染色活細胞線粒體的熒光染料,廣泛用作檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)的熒光探針。TMRE是陽離子熒光染料,在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質。在細胞凋亡發(fā)生時,線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉運孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,TMRE重新釋放出線粒體。通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化,可用于培養(yǎng)的細胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測。

四甲基羅丹明乙基酯(TMRE)在線粒體中的積累被證明是由它們的膜電位驅動的。此外,由于它們的疏水特性降低,這些探針對細胞表現(xiàn)出與羅丹明6G相比低10-20倍的電位非依賴性結合。四甲基羅丹明乙酯為動態(tài)和最佳原位定量測量熒光染料之一,比羅丹明123更好 ,因為其被活細胞快速和可逆地吸收。

TMRE比羅丹明123更快地穿過質膜,并且它們的強熒光允許使用低探針濃度,從而避免聚集。由于它們的熒光對環(huán)境相對不敏感,因此TMRE的空間分辨熒光呈現(xiàn)其跨膜分布的無偏分布,TMRE已成功用于高分辨率對于影響活細胞中線粒體膜電位的藥物的高通量篩選測定。

TMRE可以快速通過細胞膜,僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲,并且對細胞沒有毒性。TMRE的最大激發(fā)波長為549nm,最大發(fā)射波長為574nm。

檢測方法：

● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦 ● 熒光酶標儀/光度計

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機 ● PBS或者HBSS(不含酚紅)

線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE法)使用注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內壁上的液體甩至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 始終保持平衡染液中pH值的一致性,因為pH值的變化將影響膜電位。

● 根椐細胞種類、實驗條件不同流式細胞儀設置不同。

● 線粒體膜電位降低,熒光強度減弱。但是結果分析時注意排除熒光淬滅現(xiàn)象,TMRE熒光物質的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜有一部分是重合的,其發(fā)射光有一部分(與激發(fā)光重合的部分)會被自己重新吸收,而且這種吸收的效益隨著該熒光物質的濃度增加而增強。換而言之,當熒光物質濃度很高的時候其熒光強度和濃度的增加不成正比,此時注意檢測結果的分析。采用JC-1法可以減少熒光淬滅的影響。

使用方法：

染色工作液的配制：

根據(jù)樣本數(shù)量,用37℃培養(yǎng)箱預熱染料稀釋液試劑B將TMRE熒光染料10倍稀釋。再用HBSS或相應的無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液將探針TMRE進行40-200倍稀釋,配制成染色工作液。

【注】：

● 也可不用本試劑盒中的試劑B,直接用HBSS等緩沖液或相應的無血清培養(yǎng)基稀釋TMRE染料至所需濃度。

● 開始實驗前,使用HBSS緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據(jù)不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度,建議至少在超過10倍范圍的濃度下進行測試。一般染色終濃度400-2000倍稀釋,1000-2000倍適合大多數(shù)細胞樣本。

● 建議收到產品后,根據(jù)單次使用量,對母液進行小量分裝,每次使用一管,試劑-20℃避光凍存,一年穩(wěn)定。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 為了降低探針加載過度可能引起的假陽性,建議在不影響染色效果的情況下盡量使用低濃度。

● 若細胞在染色后于不含染料的培養(yǎng)基中孵育,熒光信號會衰減。

線粒體膜電位檢測試劑盒(TMRE法)懸浮細胞：

1、收集樣本細胞以及陰性、陽性對照細胞。

2、用PBS洗滌細胞兩次。離心收集細胞。

【注】：

● 300×g-500×g,2-8℃,離心時間5分鐘收集細胞。

3、用500μL TMRE染色工作液將細胞重懸,細胞密度約5-10×10⁵個/mL。37℃,5% CO₂的培養(yǎng)箱中孵育15分鐘。

4、常溫離心收集細胞。用PBS洗滌細胞2次。

【注】：

● 300×g-500×g,離心時間5分鐘收集細胞。

5、用 500μL預熱的1×染色緩沖液將細胞重懸。

6、用流式細胞儀/熒光酶標儀/分光光度計檢測分析結果,或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

貼壁細胞：

對于貼壁細胞,可以先收集細胞,重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。也可以直接原位染色后檢測。

純化線粒體：

1、把配制好的TMRE染色工作液再用TMRE稀釋液稀釋5倍。

2、0.9mL 5倍稀釋的TMRE染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg的純化的線粒體。

3、結果檢測。

組織樣本：

組織樣本可以用玻璃勻漿器勻漿成單細胞懸液后按照細胞樣本的方法檢測。也可以用其他細胞懸液制備的試劑盒處理組織后檢測。

結果分析：

檢測時可以把激發(fā)光設置為549nm,發(fā)射光設置為574nm。

線粒體膜電位降低,熒光強度減弱。

用流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位的情況。

也可以用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察；用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測。

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